МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ

УТВЕРЖДАЮ

Начальник Главного

санитарно-

эпидимиологического

управления,

Министерства

здравоохранения СССР

В.Е.Ковшило

11.01.1979 N 1959-79

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ N-НИТРОЗАМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Выборочный лабораторный контроль за содержанием в пище канцерогенных, токсичных и других чужеродных веществ является одной из главных задач гигиены питания.

Среди канцерогенов имеются соединения, образующие в пищевых продуктах в естественных условиях технологической обработки и хранения. К таким соединениям относятся N-нитрозамины (НА), обладающие высокой канцерогенной активностью. Канцерогенность НА доказана на лабораторных животных, причем эффект проявляется при действии черезвычайно низких доз НА порядка 0,075 мг/кг веса тела.

Кроме, того НА обладают мутагенными свойствами, а некоторые из них - достаточно высокой токсичностью.

В отличие от других химических канцерогенов НА представляют собой простые по химической структуре соединения общей формулы

                            R1\
                               = N-NO .
                            R2/

НА относительно стабильные вещества, хорошо растворимые во многих органических растворителях (хлористый метилен, хлороформ, эфир и др.) и умеренно в воде. Многие НА, в частности, N-нитрозодиметиламин (НДМА), N-нитрозодиэтиламин (НДЭА), N-нитрозодипропиламин (НДПА), N-нитрозодибутиламин (НДБА), N-нитрозопирролидин (НПир) и N-нитрозопиперидин (НПип) обладают высокой летучестью с водяным паром (летучие НА).

НА способны легко оборазовываться из предшественников - нитритов или нитратов и аминов или других веществ, содержащих аминогруппу. Нитриты содержатся в растениях, почве, природных водах. В этих же объектах, но в значительно больших концентрациях, имеются нитраты, которые с помощью бактерий и ферментов могут восстанавливаться в нитриты. Кроме того, нитриты и нитраты вносятся в пищевые продукты в процессе технологической обработки (копчение, соление, консервирование и др.) для фиксации цвета, увеличения срока хранения и улучшения запаха.

В ряде пищевых продуктов, особенно рыбных и мясных, содержится значительное количество аминов, которые являются промежуточными веществами метаболизма белков. Вследствие этого НА могут образовываться в пищевых продуктах в побочных условиях технологической обработки и хранения.

В плане профилактики заболеваний элиментарного происхождения важнейшее значение приобретает проведение санитарно-гигиенических исследований с целью обнаружения НА в пищевых прдуктах.

Отсутствие унифицированных надежных методов анализа микроколичеств НА затрудняет сопоставление полученных результатов и является одной из причин большого разброса опубликованных данных количественного анализа.

В пищевых продуктах в основном обнаружены НДМА, НДЭА, НПип, а в отдельных случаях также НПир, НДБА и др. Материалы, характеризующие содержание летучих НА в некоторых отечественных и зарубежных пищевых продуктах приведены в таблице.

В Институте питания АМН СССР в последние годы ведутся систематические исследования по разработке методов обнаружения, идентификации и количественного определения НА, а также по изучению содержания НА в отечественных пищевых продуктах.

В результате проведенных исследований для серийных анализов разработан относительно простой и быстрый метод определения летучих НА в различных видах пищевых продуктов, основанный на денитрозировании НА, получении флуоресцирующих и окрашенных производных взаимодействием образовавшихся вторичных аминов с 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-I,3-диазолом (НБД-хлоридом) и визуальном сравнении на хроматографической пластинке интенсивностей флуоресценции и окрасок стандартных, опытных и котрольных (отличающихся от опытных только отсутсвием НА) проб.

При необходимости возможно также точное количественное определение НА путем элюирования соответствующих зон и флуриментрирования.

К выгодным особенностям метода относяться простота выделения НА из пищевых продуктов, значительное упрощение очистки экстрактов, оценка содержания НА непосредственно на хроматографической пластинке.

Важным преимуществом метода является возможность использования в качестве стандартов на самих НА, а соответствующих вторичных аминов.

Предел обнаружения в расчете на НА составляет в УФ-свете 1-5 нг, а в видимом свете 10-30 нг в пятне. Различные окраски пятен (желтая, оранжевая, розовая) могут быть использованы для дополнительной идентификации НА.

Метод позволяет надежно определять НА в любых пищевых продуктах при содержании 1 мкг/кг ивыше. Следует подчеркнуть, что все испытательные результаты определения подтверждаются хромато-масс-спектрометрически.

Результаты сравнительного анализа ряда мясных, рыбных, молочных и овощных продуктов хромато-масс-спекрометрическим, флуориметрическим и предлагаемым нами методами близки.

Воспроизводимость предлагаемого метода относительно мало отличается от воспроизводимости хромато-масс-спекрометрического метода (коэффициент корреляции составляет 0,2-0,4 и 0,15-0,25 соответсвенно).

Продолжительность определения - 3 часа; один аналитик за рабочий день может провести 7-8 анализов.

В настоящий "Методических рекомендациях" описаны общие методические приемы проведения серийных определений НА в пищевых прдуктах и рекомендованы необходимая аппаратура и реактивы.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА

Оборудование и материалы

1. Парообразователь.

2. Колба круглодонная с длинным горлом на 1000 мл с нормальным шлифом НШ N 29 по ТУ 48-52.

3. Колба плоскодонная на 100 мл с НШ N 14,5 по ТУ 48-52.

4. Холодильник прямой с НШ N 14,5 с алонием по ГОСТ 9499-70.

5. Цилиндры мерые вместимостью 250, 100 и 50 мл по ГОСТ 1770-74.

6. Плитки электрические.

7. Весы технические по ГОСТ 19491-74.

8. Делительная воронка вместимостью 250 мл по ГОСТ 8613-75.

9. Колба для упаривания на 50 мл с НШ N 14,5 по ГОСТ 10394-72.

10. Дефлегматорная насадка по ГОСТ 20789-75.

11. Ротационный испаритель с ловушкой по МРТУ 42-2589-66.

12. Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75.

13. Баня водяная по ТУ 64-1-423-72.

14. Пипетка на 1 и 2 мл по ГОСТ 20292-74.

15. Термометр 0-100 град.C по ГОСТ 2045-71.

16. Чашки фарфоровые выпарительные, диаметр 50 мм по ГОСТ 9147-73.

17. Микропипетки на 0,1 мл по ГОСТ 1770-74.

18. Пробирки на 5 мл с НШ N 14,5 с притертыми пробками по ГОСТ 10515-7.

19. Шкаф сушильный (типа МРТУ 42-1411-61).

20. Микрошприц МШ-10 или калиброванный капилляр.

21. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель ВЗЗ МРТУ 64-1-1080-63) или ртутно-кварцевая лампа (типа ПРI-4) с фильтром, прпускающим область 360 км (типа УФС-6).

22. Камера для ТСХ с притертой крышкой, например, стеклянный четырехугольный сосуд 195х195х200 мм завода "Дружная горка".

23. * * * пластинки стеклянные 9х12 см с нанесенным слоем силикагеля КСК 0,25-0,5 мм для ТСХ (СССР).

24. Натрий сернокислый по 4166-76 хч.

25. Серная кислота по ГОСТ 14252-69 хч 8 н (22 мл H2SO4 плотностью 1,84 разбавляют 78 мл дистиллированной воды).

26. Сульфаниловая кислота по ГОСТ 5821-69.

27. Уксусная кислота ледяная по ГОСТ 61-75 или 18270-72.

28. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

29. Натрий углекислый по ГОСТ 8363 хч.

30. Едкий натрий по ГОСТ 4328-66 хч или 11078-71.

31. Эфир диэтиловый медицинский или ГОСТ 6265-52.

32. Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76.

33. Бромистоводородная кислота конц. по ГОСТ 2062-67; 3% раствор бромистоводородной кислоты в ледяной уксусной кислоте (1,4 мл HBr разбавить 18,6 мл уксусной кислоты).

34. 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол (НБД-хлорид); раствор в 0,2 мг/мл в изопропиловом спирте.

35. Спирт изопропиловый ГОСТ 5.595-70.

36. Натрий кислый углекислый по ГОСТ 4143-69; 1% раствор в дистиллированной воде.

37. Диметиламин по ТУ 6-09-1426-71 хч.

38. Диетиламин по ТУ 6-09-68-70 хч.

39. Дибутиламин по ТУ 6-09-1802-72 хч.

40. Пиперидин по МРТУ 6-09-6855-69 хч.

41. Пироллидин * * *.

42. Соляная кислота конц. по ГОСТ 3118-67 или 14261-69; водный раствор 0,5 мг/мл.

43. Этилацетат по ГОСТ 5.1070-71 хч.

44. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51 хч.

45. Бензол по ГОСТ 5955-75 хч.

1. Выделение НА из пищевых продуктов.

Схема установки для выделения НА перегонкой с водяным паром приведена на рис.1. До начала перегонки воду в парообразователе нагревают до кипячения.

В круглодонную колбу помещают 100-120 г мелко измельченного образца продукта, заливают раствором 80 г сульфата натрия, 1 г сульфаниловой кислоты и 10 мл уксусной кислоты в 200 мл воды, перемешивают 5 мин. добавляют 8 г серной кислоты. Затем колбу устанавливают в прибор для перегонки с водяным паром, подогревают ее содержимое до начала кипения и начинают перегонку. Перегонку проводят до тех пор, пока объем дистиллята не достигнет 100 мл.

2. Экстракция НА и концентрирование экстракта.

В дистилляте (100 мл) растворяют 3 г едкого натрия и 20 г углекислого натрия, охлаждают и экстрагируют НА 60 мл эфира. Слои разделяют, водный слой повторно экстрагируют 60 мл эфира. Эфирные экстракты объединяют, сушат 3-4 г сульфата натрия (безводного) и коцентрируют в колбе для упаривания (частями) на ротационном испарителе при температуре 30-35 град.С с дефлегматорной насадкой до 0,4 мл.

Схема установки для упаривания приведена на рис.2.

Дефлегматорную насадку промывают 0,3 мл уксусной кислотй.

3. Денитрозирование НА и получение производных.

К концентрату добавляют 0,4 мл 3% бромистоводородной кислоты в ледяной уксусной кислоте; смесь делят на две равные части (опыт и контроль), помещают в фарфоровые чашки и осторожно упаривают при перемешивании на плитке с асбестовой сеткой досуха. В одну из чашек (контроль) добавляют 0,5 мл 0,2% раствора углекислого натрия, перемешивают и упаривают досуха. После охлаждения в обе чашки приливают по 0,45 мл раствора НБД-хлорида, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и сливают в пробирки. В пробирки добавляют по 0,05 мл раствора кислого углекислого натрия, перемешивают, закрывают пробками и выдерживают в сушильном шкафу при темпиратуре 65+,-5 град.С в течение часа.

Приготовление стандартов. Исходный раствор (I): навески диметиламина - 0,61 г (с учетом процентного содержания в растворе), диэтиламина - 0,72 г, пиперидина - 0,75, пироллидина - 0,71 г и дибутиламина - 0,82 г количественно переносят в мерную колбу на 1 л и доводят до метки раствором соляной кислоты в воде. Концентация аминов в исходном растворе эквывалентна содержанию соответствующих НА 1 мг/мл.

При приготовлении исходного раствора допускается использование вместо навесок точно отмеренных объемов: диметиламин - с учетом процентной концентрации раствора, диэтиламин - 0,51 мл, пиперидин - 0,64 мл, пироллидин - 0,61 мл, дибутиламин - 0,60 мл.

В зависимости от поставленной задачи номенклатура аминов в исходном растворе может варьироваться, в частности, соответвующие редко встречающимся в отечественных продуктах НПир и НДБА амины могут быть опущены.

Эталонный раствор II готовят разбавлением раствора I в 10 раз (0,1 мг/мл в расчете на НА);

эталонный раствор III готовят разбавлением раствора II в 2 раза (0,05 мг/мл в расчете на НА);

эталонный раствор IV готовят разбавлением раствора III в 5 раз (0,01 мг/мл в расчете на НА).

В три пробирки наливают по 0,45 мл раствора НБД-хлорида, по 5 мкл эталонных растворов II, III и IV и по 0,05 мл раствора кислого углекислого натрия и выдерживают при 65+,-5 град.С вместе с опытными и контрольными пробами. Содержание аминов в стандартах в пересчете на НА составляет 1, 0,5 и 0,1 мг/мкл соответсвенно.

Все стандартные растворы хранят в холодильнике в герметичных стеклянных сосудах. Срок годности исходного раствора до з месяцев, а эталонных растворов - до 15 дней.

4. ТСХ разделение, идентификация и определение содержания НА в исследуемом образце.

На пластинку на линию старта (1,5-2,0 см от края пластинки) наносят по 10-20 мкл опытных, конрольных и стандартных образцов, таким образом, чтобы расстояние между пятнами было не менее 1 см, а от краев пластинки 1,5-2 см. Пластинку подсушивают на воздухе, помещают в камеру, в которую предварительно заливают смесь хлороформ-бензол-этилацетат-уксусная кислота 18:10:3:0,5, с таким расчетом, чтобы высота слоя жидкости не превышала 1 см и закрывают крышкой. Хроматографию заканчивают, когда фронт растворителя достигнет заранее отмеченной высоты (1-2 см от верхнего края пластинки). Длина пробега растворителя должна быть не менее 9-10 см. Пластинку вынимают, подсушивают на воздухе, рассматривают в видимом свете, а затем в темной комнате в УФ свете. Сравнивают интенсивности окрасок и флуоресценции стандартных, опытных и контрольных пятен с одинаковыми значениями Rf.

Содержание НА в прдукте рассчитывают по формуле:

                                  К х n
                         С = 1000 ----- , где
                                  V х M

С - содержание НА в продукте в мкг/кг;

n - содержание НА в пятне в мг;

V - объем пробы, нанесенный на пластину в мкл;

М - масса образца, взятая для анализа в г;

К - коэффициент, учитывающий полноту извлечения НА из пищевых продуктов в разных НДМА - 1,28; НДЭА - 1,16; НДБА - 1,20; НПип - 1,49; НПир - 1,40.

В случае необходимости точного количественного определения НА в пищевых продуктах, пятна опытных, контрольных и стандартных образцов с одинаковым значениями Rf соскребывает с пластинки, элюируют бензолом, центрифугируют элюаты и измеряют их флуоресценцию при лямбда возбуждении = 470 нм и лямбда флуоресценции = 520 нм.

Как правило, при измерении флуоресценции используют один стандарт, наиболее близкий к опыту.

При флуориметрическом определении содержание НА в продукте рассчитывают по формуле:

                К х N [Hоп. - Нконтр.]
     С = 1000 х ---------------------- х (мкг/кг), где
                     Нст. х V х М

N - количество НА (рассчитаное) в элюате пятна стандарта в нг;

Нст., Ноп. и Нконтр. - показания прибора при измерении интенсивности флуоресценции элюатов пятен стандарта, опыта и контроля в относительных единицах;

V - объем пробы, нанесенный на пластину в мкл;

М - масса образца, взятая для анализов в г;

К - коэффициент, учитывающий полноту извлечения НА из пищевых продуктов и равных для НДМА - 1,28; НДЭА - 1,16; НДБА - 1,20; НПип - 1,49; НПир - 1,40.

Таблица

Материалы, характеризующие содержание НА в ряде отечественных и зарубежных продуктов в мгк/кг

Продукты
НДМА
НДЭА
НПип
Летуч.НА
НДМА
НДЭА
НДБА
НПир
НПип
отечественные данные
зарубежные данные
мясо свежее
и свежеморо-
женное

не обнаружено

не обнаружено
мясо жаренное




0-4
0-4
0-1,1
0-19
0-8
мясо копченое




0-8
0-7
0-1
0-1
0-2
сосиски
0-5,6
0-2,3
0-1,7

0-84
0-7

0-40
0-50
колбасы
варенные,
(чайнная,отде-
льная,докторс-
кая и др.)




0-5,4




0-6,1




0-2,6






хлеб мясной
0-3,9
0-2,9
0-2,0

0-12
0-16

0-18
0-50
колбасы полу-
копченые (кра-
ковская,украи-
ская и др.)



0-13



0-5,2



0-3,8






колбасы
свинные

0-12

0-11

0-58


0-15

0-5


0-33

колбасы свин-
ные со специя-
ми






0-80




0-80


0-1600
колбасы сыро-
капченые (там-
бовская, сове-
тская,салями)



0-5,5



0-5,1



0-3,7




0-80



0-0,3



0-3,9



0-4,3



0-0,4
ветчина,
окорок

0-2,6

0-1,5

0-2,4


0-6

0-2,8

0-0,7

0-20

0-12
бекон




0-30
0-13

0-40

бекон жареный




0-30
0-4,3
0-1,5
0-207
0-8,2
консервы
мясные





0-45



0-105

0-60
рыба свежая



0-5
0-9
0-4

0-3

рыба жареная и
печеная




0-10

0-18

следы



рыба холодного
копчения

0-4

0-2


0-54

0-22




рыба горячего
копчения

0-22

0-4


0-75

0-10



0-4

консервы
рыбные




0-12

0-25



0-3

рыбная мука




5-2000
0-36



икра черная



0-10





морские про-
дукты (кревет-
ки,гребешок и
др.)







0-12





0-37

молоко
не обнаружено
0-3




сыры разные
0-3
0-2


0-4
0-2

0-1

зерновые
не обнаружено









0-2





фрукты разные
не обнаружено





яблоки
0-1



0-2




овощи свежие
и вареные

не обнаружено





свекла после
хранения

0-1,5




0-5




шпинат после
хранения





0-500

0-100


0-5

бобы соевые




0-20
0-19



соления




0-63


0-19