МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Главного

санитарного врача МЗ СССР

В.Е.Ковшило

20.10.1976 N 1514-76

Методические рекомендации об определении свободного формальдегида в биосредах методом тонкослойной хроматографии

ВВЕДЕНИЕ

Формальдегид H*COH, молекулярный вес 30,03. Бесцветный газ с резким запахом. Порог восприятия запаха 0,2 мг/куб.м. Температура плавления 92 град.С, температура кипения - 21 град.С. Хорошо растворим в воде; 35-40% водный раствор формальдегида называется формалином. Он легко полимеризуется с образованием параформальдегида, легко конденсируется с аммиаком, аминами и фенолами. Формальдегид находит большое применение при производстве полимерных материалов на основе мочевино-формальдегидной, феноло-формальдегидной и др. смол.

Для определения формальдегида в биосредах в литературе описан метод, основанный на способности формальдегида восстанавливать окраску бесцветного раствора фуксинсернистой кислоты [1]. Однако он оказался недостаточно чувствительным при определении H*COH в органах подопытных животных, подвергавшихся длительной затравке формальдегидом на уровнях, соответствующих его выделению из полимерных материалов. По этой же причине оказался неудовлетворительным метод, описанный в работе [2].

Настоящий метод предназначен для определения формальдегида в печени, почках, легких, мозге подопытных животных. Извлечение формальдегида из органов животных делалось так, как описано в работе [1], синтез формдимедона по прописи, представленной в руководстве [3], условия хроматографирования и количественного определения формдимедона разработаны авторами.

Принцип метода

1. Метод основан на извлечении формальдегида из органов, его взаимодействии с димедоном (5,5-диметилдигидрорезорцином) с последующим выделением продукта взаимодействия (формдимедона) в тонком слое сорбента. В качестве алюента применяется хлороформ. Проявление пластины осуществляется хлороформенным раствором йода.

2. Открываемый минимум - 0,2 мкг в пробе.

3. Веществ, мешающих определению, не установлено.

Реактивы, растворы

1. Соляная кислота (d=1,19), "хч", ГОСТ 3118-67; Ін; 0,1н р-ры.

2. Димедон, "ч", ГОСТ 6622-53, перекристаллизованный; 5% спиртовый р-р, свежеприготовленный.

3. Гидроокись натрия, "хч", ГОСТ 4328-66; 0,1н; 0,05н и 20% р-ры.

4. Спирт этиловый, ректификат, ГОСТ 5962-67; перегнанный.

5. Вода, бидистиллат.

6. Бромфеноловый синий, "чда", ГОСТ ТУ 6-03-311-70.

7. Ацетат натрия, "ч", ТУ 6-09-246-70.

8. Нитрат серебра, "хч", ГОСТ 1277-63; 0,1н р-р.

9. Хлороформ, "хч", ГОСТ 3160-51.

10. Трихлоруксусная кислота, "ч", МРТУ 6-09-2299-65; 5% р-р.

11. Йод, "чда", ГОСТ 4159-64.

12. Крахмал растворимый, для йодометрии, ГОСТ 10163-62.

13. Формалин медицинский, ГФ-10.

14. Буферный р-р: смешивают 2 объема Iн р-ра ацетата натрия с 1 объемом Iн р-ра HCl, pH=4,0.

15. Бромфеноловый синий: 0,1 г индикатора растворяют в 3 мл 0,05н p-pa NaOH в мерной колбе емкостью 250 мл, добавляют горячей бидистиллированной воды, остывший р-р взбалтывают в мерной колбе, затем доводят до метки водой и хорошо перемешивают.

16. Проявляющий р-р: 0,5% р-р йода в хлороформе и 1% р-р крахмала.

     17. Синтез  формдимедона:  в  стакан  вносят  5  мл  4%  р-ра
формальдегида,  прибавляют 0,5 мл  5%  спиртового  р-ра  димедона,
подкисляют несколькими   каплями   0,1н  р-ра  HCl  в  присутствии
бромфенолового синего. Затем прибавляют несколько капель 0,1н р-ра
NaOH  до  изменения  окраски  в красно-фиолетовую и 5 мл буферного
р-ра.  Содержимое стакана оставляют стоять на 12 часов, после чего
фильтруют через  стеклянный  фильтр  с  пористой  пластинкой  N 4.
Осадок промывают бидистиллированной водой до отрицательной реакции
на  ион хлора (проба с р-ром AgNO )  и сушат до постоянной массы в
                                 3
течение 4,5 часов при температуре 100 град.С.

18. Стандартный р-р формдимедона концентрацией 50 мкг/мл готовится обычным способом.

Приборы и посуда

1. Центрифуга.

2. Форвакуумный или водоструйный насос.

3. Стеклянная ловушка.

4. Стеклянные пластинки размером 9х12 см.

5. Поглотитель Полежаева на шлифе с оттянутым концом.

3. Мерные колбы для приготовления стандартного р-ра, микропипетки.

7. Батарейные стаканы.

8. Пульверизатор.

9. Реактивные склянки.

10. Фарфоровые чашки.

Приготовление пластин для хроматографии

Тщательно вымытые хромовой смесью пластины промывают водой, затем дистиллированной водой, сушат в сушильном шкафу, а потом на них наносят слой сорбента. Для приготовления сорбционной массы использовался силикагель марки КСК и медицинский гипс, которые предварительно просеивались через сито с отверстиями с частотой ячеек 100 меш. Адсорбционная масса готовилась следующим образом:

14 г силикагеля + 1 г гипса + 50 мл дистиллированной воды смешивают и интенсивно встряхивают в плоскодонной колбе в течение 20 минут. Однородную массу наносят на 10 пластинок и встряхиванием добиваются равномерного распределения слоя на поверхности каждой пластины.

Стеклянные пластинки после нанесения слоя сорбента сушат на воздухе в течение суток. В дальнейшем пластинки хранят в эксикаторе.

Описание определения

0,5 г органа подопытного животного (печени, почек, легких, мозга) тщательно растирают в ступке, желательно с кварцевым песком. Затем прибавляют 3 мл 5% трихлоруксусной кислоты, перемешивают и переносят в пробирку. Чашку дважды ополаскивают 2 мл бидистиллированной воды и смывы также переносят в пробирку. Содержимое пробирки центрифугируют, жидкость над осадком осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и к фильтрату по каплям прибавляют 20% раствор NaOH до нейтральной реакции (проба с лакмусовой бумажкой). Далее прибавляют 0,2 мл раствора димедона и проводят синтез формдимедона так, как описано выше.

После того как проба была выдержана 12 часов при комнатной температуре, ее переносят в испаритель и упаривают под вакуумом досуха. В качестве испарителя можно использовать поглотитель Полежаева. Чтобы ускорить процесс упаривания, целесообразно между насосом и испарителем поместить ловушку со льдом. Остаток растворяют в 0,1 мл этилового спирта.

     В период  обработки органа,  проведения синтеза формдимедона,
упаривания растворов возможно попадание формальдегида в  пробу  из
воздуха.  Поэтому  для контроля в той же постановке опыта проводят
анализ соответствующего органа животного,  которое не подвергалось
затравке.   Результаты   анализа   учитываются  при  окончательном
расчете.  Проба и контроль  наносятся  на  середину  пластинки  на
расстоянии 1  см  от  нижнего  края.  Во  избежание  потерь стенки
испарителей аккуратно споласкивают спиртом и смывы переносят в  те
же  точки,  куда  были  нанесены проба и контроль.  Слева и справа
наносят пятна стандартного раствора формдимедона в количестве 0,2;
0,4;   0,6   мкг,   что   соответствует  0,004;  0,008;  0,012  мл
стандартного раствора.  Для ускорения процесса высыхания пятен  на
пластине ее  подогревают  феном.  Разделение вещества производят в
камере с насыщением,  представляющей собой  сосуд  любой  формы  с
притертой  крышкой,  на  дно  которого наливают смесь хлороформа с
ацетоном (ацетон  добавляется  в   количестве   1/10   от   объема
хлороформа).  После подъема растворителя на высоту 10 см пластинку
вынимают,  сушат на воздухе и опрыскивают хлороформенным раствором
йода.  На  пластинке  появляются желтые пятна.  После подсушивания
пластинки и обработки  ее  раствором  крахмала  пятна  приобретают
синий  цвет.  Непрореагированный  димедон дает пятно около старта;
формдимедон - с R  = 0,4-0,5.
                 f

Расчеты

Количество вещества в пробе определяется путем сравнения площади пятна пробы с площадью пятен стандартных растворов. Количество определяемого формальдегида в пробе (в том или ином органе) рассчитывается в мкг/г по формуле:

                          C1 - C2
                      g = ------- мкг/г, где
                            0,5

C1 - количество формальдегида в органе подопытного животного, мкг;

C2 - количество формальдегида в органе контрольного животного, мкг;

0,5 - навеска взятого для анализа органа, г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Перегуд Е.А. Санитарная химия полимеров, Изд-во "Химия", Л., 1967, стр. 60.

2. Розенберг П.Я., Беялко Н.К. Химические методы исследования биологических субстратов в профпатологии. М., Изд-во "Медицина", 1969, стр. 171-173.

3. Nash T., The colorimetric estamation of formaldehyde by means of the Hantrsch Reaction, Biochem. J. 1953.55.3.416.