МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

Н А К А З

26.10.2004 N 521

Про затвердження методичних вказівок "Медико-біологічні дослідження виробничих штамів мікроорганізмів і токсиколого-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обґрунтування гігієнічних нормативів і регламентів"

Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення"4004-12 НАКАЗУЮ:

1. Затвердити методичні вказівки "Медико-біологічні дослідження виробничих штамів мікроорганізмів і токсиколого-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обґрунтування гігієнічних нормативів і регламентів" (додаються).

2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України методичні вказівки довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України Бережнова С.П.

Перший заступник Міністра,
Головний державний
санітарний лікар України


О.В.Лапушенко

ЗАТВЕРДЖЕНО

Наказ МОЗ України

26.10.2004 N 521

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

"Медико-біологічні дослідження виробничих штамів мікроорганізмів і токсиколого-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обґрунтування гігієнічних нормативів і регламентів"

1. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ

1.1. Методичні вказівки призначені для спеціалістів, які займаються обґрунтуванням гігієнічних нормативів виробничих штамів мікроорганізмів-продуцентів і готових форм препаратів, які їх вміщують, в об'єктах виробничого та навколишнього середовищ. Штам мікроорганізмів - це генетично однорідна популяція мікроорганізмів з певними стабільними специфічними морфологічними, культуральними і біохімічними властивостями.

1.2. Методичні вказівки складені з урахуванням особливостей токсиколого-гігієнічної оцінки біологічних препаратів на основі виробничих штамів мікроорганізмів. Виробничий штам - штам мікроорганізмів, який використовується в промисловості при виробництві того чи іншого продукту (біопрепарату). Патогенні мікроорганізми не допускаються до використання як виробничі. Штам-продуцент - штам мікроорганізмів, що продукує ту чи іншу речовину (антибіотик, фермент та ін.) і використовується для одержання кінцевого продукту (тобто продукту біотехнології). Біотехнологія - технологія виробництва продуктів при використання живих клітин організмів (мікроорганізмів, рослин, тварин).

1.3. До виробничих штамів мікроорганізмів належать мікроорганізми різних категорій (гриби, бактерії), що є дійовими чинниками біопрепаратів або продуцентами біологічно активних речовин, які використовуються для створення препаратів для різних галузей народного господарства та охорони здоров'я (мікробіологічні засоби захисту рослин від шкідників та хвороб, стимулятори росту рослин та мікробіологічні добрива, антибіотики, ферменти, вітаміни, амінокислоти, субстанції для лікарських препаратів, кормові білки, харчові добавки, деструктори хімічних забруднювачів і ін.).

1.4. Мікробний препарат - це препарат, що містить в своєму складі як діючий інгредієнт життєздатні мікроорганізми в нативному або висушеному стані. Мікробні препарати можуть в своєму складі мати як монокультури, так і асоціації мікроорганізмів різних груп, вони можуть містити або тільки мікроорганізми (наприклад, препарати для харчової промисловості) або, крім мікроорганізмів, продукти їх життєдіяльності, різні мінеральні та органічні наповнювачі, стабілізатори, емульгатори, консерванти, принадні продукти (наприклад, мікробні пестициди, стимулятори росту рослин, мікробіологічні добрива).

На відміну від хімічних речовин, мікроорганізми є живими об'єктами, здатними зберігати життєздатність і розмножуватись при наявності певних умов в навколишньому середовищі або в макроорганізмі. Продукти біотехнології, що містять в своєму складі виробничі штами мікроорганізмів, як правило, не токсичні для теплокровних організмів, але можуть викликати дисбіотичну, сенсибілізуючу, імуномодулюючу чи іншу специфічну дію.

Використання виробничих штамів мікроорганізмів та виробництво препаратів на основі мікробного синтезу здійснюється підприємствами мікробіологічної промисловості та територіальними біотехнологічними підприємствами різної потужності, біофабриками та біолабораторіями. Штами, зареєстровані як збудники інфекційних захворювань у людей та корисних тварин, до застосування як виробничі не дозволяються.

1.5. Мета запропонованих методичних вказівок - сприяти отриманню однорідних даних, що можна зіставити, а також вибору і проведенню оптимального обсягу досліджень, необхідних для обґрунтування гігієнічних регламентів виробничих штамів мікроорганізмів і готових форм препаратів, які їх вміщують. Передбачений цими методичними вказівками обсяг дослідження - обов'язковий мінімум для дослідників, однак він не є перешкодою для використання інших методів при умові їх обґрунтування.

Дослідження передбачають оцінку небезпеки виробничого штаму мікроорганізмів та продуктів біотехнології на їх основі при надходженні в організм лабораторних тварин шляхами, адекватними реальним умовам трудової діяльності і проживанню людини, з метою вибору лімітуючого критерію шкідливості і встановлення ГДК (гранично допустимої концентрації).

1.6. Проведення токсиколого-гігієнічних досліджень і визначення патогенних властивостей нових виробничих штамів мікроорганізмів, розробка ГДК штамів і продуктів біотехнології на основі мікроорганізмів, визначення небезпеки для здоров'я цих продуктів здійснюється лабораторіями науково-дослідних установ різних відомств, які акредитовані в установленому порядку Комітетом з питань гігієнічного регламентування МОЗ України.

Гігієнічному регламентуванню підлягають штами мікроорганізмів, що пройшли у вказаних установах первинну токсиколого-гігієнічну оцінку як діючі чинники біопрепаратів або як продуценти для мікробіологічного синтезу і отримали в установленому порядку дозвіл МОЗ України на їх використання в технологічних процесах, а також готові форми препаратів, виготовлені на основі цих мікроорганізмів або продуктів їх метаболізму.

1.7. У разі направлення на токсиколого-гігієнічні дослідження виробничого штаму (чи групи штамів) мікроорганізмів розробнику (власнику штаму) необхідно надати паспорт штаму з відомостями про його таксономічне положення, джерело виділення, культурально-морфологічні і біохімічні властивості, тести і критерії ідентифікації, умови культивування, спосіб застосування.

У разі направлення на дослідження готового біопрепарату необхідно надати відомості про склад препарату (вміст діючого інгредієнта і сторонньої мікрофлори, наповнювачів, емульгаторів та інших допоміжних речовин, агрегатний стан, призначення, спосіб виробництва).

1.8. В останні роки в зв'язку з розвитком біотехнології пропонується промислове використання генетично модифікованих мікроорганізмів. Ступінь їх небезпеки залежить не тільки від патогенних властивостей штаму-хазяїна і рекомбінантної ДНК, здатності до виживання в об'єктах виробничого і навколишнього середовища, але, особливо, від здатності до передачі генетичної інформації іншим організмам. В зв'язку з відсутністю методичних підходів до гігієнічного регламентування таких штамів і недостатністю наукових даних для розробки критеріїв оцінки їх потенційної небезпеки, викид генетично-модифікованих мікроорганізмів в процесі виробництва в повітря робочої зони і в навколишнє середовище забороняється. При отриманні необхідних даних це положення може бути переглянуте.

1.10. При проведенні досліджень з мікроорганізмами слід обов'язково дотримуватись правил техніки безпеки при роботі з мікроорганізмами з метою запобігання зараженню експериментаторів та лабораторних тварин згідно з ДСП 9.9.5-080-02 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю".

2. ПРИНЦИПОВА СХЕМА ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Дослідження з токсиколого-гігієнічної оцінки мікробних препаратів включають декілька етапів:

1) дослідження небезпечної дії виробничого штаму мікроорганізму-продуценту,

2) токсикологічні дослідження готової форми мікробного препарату,

3) гігієнічні дослідження.

2.2. Вивчення дії на організм теплокровних тварин нових виробничих штамів мікроорганізмів є першим етапом досліджень при проведенні гігієнічного регламентування мікробних препаратів в об'єктах виробничого та навколишнього середовищ, спрямоване на з'ясування патогенності мікроорганізму, під якою розуміється потенційна здатність останнього викликати специфічне (інфекційне) захворювання в макроорганізмі певного виду. Патогенність є видовою генетичною ознакою мікроорганізму і визначається багатьма факторами, так званими "факторами патогенності", основними з яких є інфекційність, інвазивність та токсичність.

Інфекційність - здатність викликати інфекційний процес в природних умовах, тісно пов'язана з інвазивністю - здатністю долати захисні бар'єри організму, проникати і розмножуватись в його тканинах. Інвазивність здійснюється за допомогою певного набору засобів, до числа яких, зокрема, належить капсульна речовина мікроорганізмів, яка захищає їх від фагоцитозу, гемолізини, лейкоцидіни, коагулаза, фібринолізин і ряд інших.

Токсичність - здатність за допомогою токсичних продуктів бактеріальної клітини (екзо- та ендотоксинів) втручатись в метаболічні функції хазяїна, порушуючи сталість його внутрішнього середовища.

2.3. Багаторічний досвід вивчення виробничих штамів мікроорганізмів-продуцентів та впливу їх на стан здоров'я осіб, постійно контактуючих з ними при виробництві біотехнологічних продуктів, свідчить про можливу здатність цих об'єктів викликати також алергенну чи дисбіотичну дію.

Отже, принципова схема досліджень небезпеки виробничих мікроорганізмів включає в подальшому вивчення наступних типів дії: патогенності, імунотоксичності і дисбіотичної дії.

2.4. На другому етапі токсиколого-гігієнічних досліджень проводять вивчення готової форми мікробного препарату, що містить живі вегетативні клітини мікроорганізмів або спори).

При токсиколого-гігієнічній оцінці мікробного препарату перш за все слід враховувати чисельність мікроорганізмів і стан, в якому вони знаходяться в препараті (висушені чи нативні клітини) і від якого залежить їх патогенність. На останню можуть впливати також і інші компоненти, які входять в мікробний препарат: продукти життєдіяльності, залишки поживного середовища, різні мінеральні й органічні наповнювачі, стабілізатори, емульгатори і т. і. Кожна з цих речовин може діяти на організм як самостійно, так і в комплексі з мікроорганізмом, посилюючи дію останнього.

Тому в доповнення до досліджень, які проводяться для визначення безпеки виробничого штаму мікроорганізмів - основного діючого чинника препарату, визначають також загальнотоксичну дію препарату в гострих і субхронічних експериментах, виявляють сенсибілізуючу і дисбіотичну дію, подразнюючу дію на шкіру.

2.5. При наявності виробництва (дослідного або промислового) проводиться гігієнічне дослідження умов виробництва, мікробіологічне дослідження повітря робочої зони і атмосферного повітря.

При вивченні мікробних препаратів, які при застосуванні вносяться в навколишнє середовище (наприклад, мікробні пестициди, добрива і стимулятори росту рослин, мікробні деструктори) вивчають виживання мікроорганізмів, що входять до складу мікробного препарату, в об'єктах навколишнього середовища і вплив на процеси мікробного самоочищення води і ґрунту.

3. МЕТОДИ ТОКСИКОЛОГО-ГІГІЄНІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ВИРОБНИЧИХ ШТАМІВ МІКРООРГАНІЗМІВ

3.1. Передумови проведення досліджень

3.1.1. При проведенні робіт по дослідженню штамів мікроорганізмів необхідно використовувати свіжу культуру продуценту, яку вирощують враховуючи швидкість росту і того віку культури, при якому згідно регламенту конкретного виробництва найбільш вірогідне потрапляння штаму в повітря виробничого і навколишнього середовищ. При цьому використовують ті поживні середовища, які забезпечують оптимальний ріст досліджуваної культури.

3.1.2. Методичні вказівки включають спеціальні тести, необхідні для визначення патогенної/токсичної дії мікроорганізмів на організм теплокровних тварин. Слід зазначити, що розрахунки доз мікроорганізмів, які вводяться в організм, проводиться не так, як для хімічних речовин, коли кількість препарату виражається, як правило, в мг на кг маси тварини чи людини. При оцінці небезпеки мікроорганізмів такі розрахунки непридатні, тому що видова сприйнятливість макроорганізму до мікроорганізму має не менше значення, ніж патогенні властивості мікроорганізму, в зв'язку з чим доза мікроорганізмів, що вводиться, виражається не в мг, а по кількості мікробних клітин на весь організм, а не на його вагу. Виражається ця кількість в одиницях введених мікроорганізмів на одну експериментальну тварину: для бактерій за таку одиницю приймається утворення, що продукує одну колонієутворюючу одиницю (КУО) на відповідному твердому поживному середовищі, для грибів - окрема спора, що визначається мікроскопічно або дає одну КУО на відповідному поживному середовищі.

3.1.3. Для отримання біомаси мікроорганізмів культуру декілька разів відмивають від поживного середовища в фізіологічному розчині при повторному центрифугуванні, потім із маточної завісі за оптичним стандартом мутності готують потрібні концентрації мікроорганізмів у фізрозчині для введення лабораторним тваринам.

3.1.4. Дослідження проводять з використанням лабораторних статевозрілих тварин молодого віку: білі миші (маса тіла 16-18 г), білі щури (маса тіла 120-160 г), морські свинки (маса тіла 200-250 г), кролики (маса тіла 1500-2000 г). Вказується лінія, стать тварин, з якого розплідника отримані, харчовий раціон і інші умови, при яких проводилась кожна серія експериментів.

Умови утримання тварин повинні відповідати вимогам "Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" (МЗ СССР, 1973) та методичних рекомендацій "Содержание лабораторных животных и уход за ними в учреждениях Минздрава УССР" (МЗ УССР, 1976).

Підбір тварин і формування з них однорідних контрольних і дослідних груп здійснюють з урахуванням однакової маси тіла (різниця не повинна перевищувати (20% середньої маси кожної статі)), відсутності різниці в поведінці, загальному стані, вмісті лейкоцитів в крові і стані нормальної мікрофлори організму. Тварини не повинні мати паразитів і патогенних мікроорганізмів. Дотримуються також загальноприйнятих правил при роботі з мікроорганізмами.

3.1.5. Мікроорганізми вводяться тваринам у вигляді гомогенної суспензії в стерильному фізіологічному розчині NaCl. При виготовленні суспензії мікроорганізми обережно в стерильних умовах гомогенізують в фізіологічному розчині. Густота суспензії залежить від природи мікроорганізму, кількості його клітинних елементів у розчині. При визначенні робочої концентрації клітин в суспензії користуються оптичним стандартом мутності або камерою Горяєва відповідно морфології і величини клітин (бактерії чи гриби).

3.1.6. Гомогенізація суспензії і асептичність є обов'язковими умовами підготовки матеріалу для експериментального зараження. Максимальний об'єм рідини, що може бути введений одноразово, залежить від виду тварини. При пероральному введенні мишам вводять культуру мікроорганізмів в об'ємі, що не повинен перебільшувати 1 мл для мишей і 5 мл для щурів. Діапазон відхилень повинен бути мінімальним. При інтраназальному зараженні суспензію мікроорганізмів вводять під легким ефірним наркозом мишам в об'ємі 0,07-0,05 куб. см і щурам - 0,05-0,2 куб. см. При внутрішньочеревинному зараженні суспензію вводять мишам в об'ємі 0,1 куб. см і щурам - 0,25 куб. см.

3.2. Визначення патогенності мікроорганізмів

     3.2.1. Умовною   мірою   патогенності  мікроорганізмів  є  їх
вірулентність, яка виражається ЛД   - дозою життєздатних мікробних
                                 50
клітин, що спричиняє загибель 50% заражених тварин.
     Визначення дози для  введення  в  організм  експериментальних
тварин залежить від роду і виду мікроорганізмів,  до яких належить
штам,  що вивчається. В гострих експериментах слід використовувати
                               8
одну  дозу  -  не  менше ніж 10  КУО/тварину при надходженні через
                        6
шлунок і не менше ніж 10  КУО/тварину при надходженні через органи
дихання (інтраназально).
     Вірулентність визначають  на  2-х  видах   тварин,   віддаючи
перевагу  мишам  та  щурам.  При  використанні  інших видів тварин
досліднику необхідно  обгрунтувати  причини  такої  альтернативної
заміни.  Вірулентними вважаються штами мікроорганізмів,  ЛД   яких
                                                           50
                                         8
при надходженні через шлунок менше ніж 10  КУО/тварину для мишей і
                9
менше   ніж   10    КУО/тварину   для  щурів,  а  при  надходженні
                            6
інтраназально - менше ніж 10  КУО/тварину для мишей  і  менше  ніж
  7
10  КУО/тварину для щурів.
     Якщо штам за величиною  ЛД    є  вірулентним,  то  проведення
                               50
подальших  досліджень  цього  штаму  не доцільне.  В цьому випадку
замовнику   видається   висновок   про   вірулентність   штаму   і
неможливість  його використання в виробництві.  Невірулентні штами
підлягають подальшим дослідженням.

3.2.2. При визначенні вірулентності досліджуваних мікроорганізмів використовують живі мікроорганізми, при визначенні токсичності - інактивовані мікроорганізми. Інактивацію слід здійснювати тим способом, який би дозволяв не руйнувати мікробну клітину. Краще всього використовувати прогрівання мікробної суспензії на водяній бані при 60-80 град. С впродовж 1 години.

Токсичність   визначається  за  токсикометричним  показником  ЛД
                                                                50
інактивованих мікроорганізмів.

3.2.3. В експерименті по визначенню інфекційності повинно бути не менше 6 дослідних тварин (по 3 тварини кожної статі). При цьому використовують суспензію живих мікроорганізмів. Контрольні тварини отримують замість мікробної суспензії відповідний об'єм фізіологічного розчину.

Спостереження за тваринами проводять впродовж 15 днів в разі зараження бактеріями і 30 днів - в разі зараження грибами. При цьому враховують зовнішній вид і поведінку тварин, проводять термометрію, визначення маси тіла, досліджують наявність мікроорганізмів в крові, внутрішніх органах і виділеннях тварин і швидкість очистки організму від них, проводять морфологічні дослідження крові. Особливу увагу слід приділяти спостереженням за появою тремору, конвульсій, проносу, сонливості, слинотечі і інших симптоматичних проявах інфекційності.

При виявленні загибелі тварин, а також після їх забою проводять бактеріологічні та морфологічні дослідження внутрішніх органів тварин.

3.2.4. Якщо в експериментальних дослідженнях не виявлено будь-яких клінічних симптомів і відхилень в загальному стані лабораторних тварин, мікроорганізми не інвазивні (тобто не здатні проникати в клітини організму) і не інфекційні, слід вважати такі мікроорганізми не патогенними. Подаються первинні дані дослідів у вигляді таблиць і результатів статистичної обробки.

3.3. Вивчення подразнюючої/запальної дії на слизову оболонку ока

     3.3.1. В умовах промислового виробництва, а в ряді випадків і
застосування  мікробних   препаратів   (наприклад   в   сільському
господарстві),     можливе     потрапляння    виробничих    штамів
мікроорганізмів на  відкриті  ділянки  шкіри  і  слизові  оболонки
працюючих.   В   зв'язку   з  цим  при  лабораторному  дослідженні
патогенних  властивостей  мікроорганізмів  проводиться  визначення
впливу виробничих мікроорганізмів на кон'юнктиву очей кроликів, як
загальноприйняту модель, що застосовується для вивчення пошкоджень
слизових  оболонок,  а також на шкіру кролів (бажано,  альбіносів)
або морських свинок. В кон'юнктивальну порожнину одного ока кролів
вводиться    0,1   мл   суспензії   культури   мікроорганізмів   в
                                               7
фізіологічному розчині,  що містить не менше 10  КУО.  Інше око  є
контрольним. Для контролю не потрібна окрема група тварин, тому що
кожна експериментальна тварина є в той же час  і  контролем  (одне
око - дослідне, друге - контрольне).

В експерименті повинно бути використано не менше 6 кролів. До початку експерименту ретельно досліджуються обидва ока, тварини з будь-яким ушкодженням слизової оболонки не повинні використовуватись. Нанесення суспензії мікроорганізмів в кон'юнктивальну порожнину здійснюється після м'якого відведення нижньої повіки від очного яблука. Потім повіки зводять разом впродовж 1 сек., щоб запобігти витіканню суспензії. Спостереження за тваринами проводяться щоденно впродовж 15 днів після введення при дослідженні бактерій і 21 дня після введення грибів. При дослідженні стану ока і кон'юнктиви використовуються бінокулярна лупа, прожекторна лампа, інші оптичні засоби.

3.3.2. Оцінка пошкоджуючої дії на слизові оболонки ока кроля проводиться згідно таблиці 1 (за Majda i Chrusaielska).

Таблиця 1 Оцінка пошкоджуючої дії мікроорганізму на слизову оболонку

Показники
Бали
А. Гіперемія кон'юктиви і рогівки:

Судини ін'єційовані
1
Окремі судини важко розрізнити
2
Дифузне глибоке почервоніння
3
Б. Набряк вій:

слабий набряк
1
виражений набряк з частково вивернутими віями
2
внаслідок набряку око закрите наполовину
3
внаслідок набряку око закрите повністю
4
В. Виділення:

мінімальна кількість виділень
1
кількість виділень зволожує віки
2
кількість виділень зволожує віки і навколишню шкіру
3

При різко виражених пошкодженнях ока сумарна кількість балів дорівнює 10.

Спеціальних дослідів по виявленню сенсибілізуючої дії мікроорганізмів-продуцентів не проводять оскільки вони, як не властиві для макроорганізму живі клітини, є облігатними алергенами і відрізняються лише ступенем прояву даного ефекту.

4. ВИЗНАЧЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ МІКРОБНОГО ПРЕПАРАТУ

4.1. Визначення токсичності мікробного препарату в гострих експериментах

     4.1.1. Токсичність  мікробних  препаратів визначається шляхом
вирахування ЛД   при різних шляхах введення лабораторним  тваринам
              50
(білим  мишам  і щурам) - в шлунок,  через органи дихання в різних
концентраціях в фізіологічному розчині. Передається цей показник в
залежності від шляхів введення в мг/кг і КУО/тварину (при введенні
в шлунок) і в КУО/куб.  м (при  введенні  через  органи  дихання).
перерахування кількості  введених інтраназально мікроорганізмів на
концентрацію їх в повітрі наведено в розділі 4.2.

4.1.2. Введення класифікації виробничих штамів мікроорганізмів за класами небезпеки, як це прийнято в профілактичній токсикології, не є доцільним, оскільки всі мікроорганізми, що дозволяються МОЗ України як виробничі штами, відносяться до непатогенних і/або в окремих випадках до умовно патогенних. За класифікацією ВООЗ ці мікроорганізми відносяться до II групи ризику (помірний індивідуальний ризик і обмежений ризик для населення в цілому), тобто за ступенем небезпеки відповідають III класу згідно ГОСТ 12.1.007-76 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

4.2. Визначення субхронічної токсичності мікробних препаратів

     4.2.1. Дослідження    передбачають    визначення   лімітуючих
критеріїв шкідливості і встановлення ГДК в повітрі робочої зони  і
атмосферному повітрі.  При проведенні експерименту при надходженні
мікроорганізмів    через    органи     дихання     (інтраназально)
використовують ті види лабораторних тварин, які виявились найбільш
чутливими в гострих  експериментах.  Використовують  не  менше  20
дослідних  тварин  (по 10 кожної статі),  які отримують щоденно не
        4
менше 10  життєздатних клітин на тварину для умов робочої  зони  і
           3
не менше 10  для умов атмосферного повітря.

4.2.2. Перерахування введеної кількості мікроорганізмів на концентрацію їх в повітрі, що вдихається, здійснюється за формулою:

                            K = D : V,                         (1)

де:

К - кількість мікробних клітин в 1 куб. м повітря (КУО/куб. м),

Д - кількість мікробних клітин, введених тварині (КУО/тварину),

V - об'єм повітря, що вдихається (куб. м).

Величина об'єму повітря, що вдихається (V), визначається як добуток легеневої вентиляції для даного виду тварин на масу тіла і терміну інгаляції (2 години на добу для мишей і 4 години для щурів і морських свинок при обґрунтуванні ГДК в повітрі робочої зони і 24 години при обґрунтуванні ГДК в атмосферному повітрі населених місць).

Показники легеневої вентиляції (в куб. см/г/хв) складають: для мишей - 1,24, щурів - 0,65, морських свинок - 0,33.

4.2.3. Приклади розрахунків величини легеневої вентиляції для щурів:

А. Фіксоване значення величини легеневої вентиляції впродовж 4-годинної експозиції для щурів вагою 200 г складає:

               0,65 куб. см/г/хв х 200 г х 240 хв = 0, 0312 куб. м
   V (4 год) = ---------------------------------------------------
                         1000000 (перерахування в куб. м)

Б. Фіксоване значення величини легеневої вентиляції впродовж 24-годинної експозиції складає для щурів:

               0,65 куб. см/г/хв х 200 г х 1440 хв = 0,1872 куб. м
  V (24 год) = ---------------------------------------------------
                                    1000000

4.2.4. Приклади розрахунків величини легеневої вентиляції для мишей:

А. Фіксоване значення величини легеневої вентиляції впродовж 4-годинної експозиції для мишей вагою 18 г складає:

     V (4 год) = 1,24 куб. см/г/хв х 18 г х 240 хв = 0,0027 куб. м
                 -------------------------------------------------
                                    1000000

Б. Фіксоване значення величини легеневої вентиляції впродовж 24-годинної експозиції складає для мишей:

    V (24 год) = 1,24 куб. см/г/хв х 18 г х 1440 хв = 0,032 куб. м
                 -------------------------------------------------
                                    1000000
     4.2.5.  Приклади  розрахунку  концентрації  мікроорганізмів в
                                                                 4
повітрі  при  інтраназальному  введенні  щурам  масою  200  г  10
КУО/тварину:

А. Для умов робочої зони:

                 К = 10000  = 3,2 х 105 КУО/куб. м
                     ------
                     0,0312

Б. для умов атмосферного повітря:

                                     4
                 К = 10000  = 5,3 х 10 КУО/куб. м
                     ------
                     0,1872

4.2.6. Щоденно спостерігають за загальним станом тварин, станом шкіри і шерстяного покрову, споживання корму і води. Особлива увага приділяється проявам симптомів проносу, конвульсій, сонливості, слинотечі. Маса тварин визначається перед введенням матеріалу, через 1 міс, при загибелі тварин і при забої. При загибелі тварин і при забої проводиться розтин тварин, бактеріологічне і гістологічне дослідження внутрішніх органів. Через 1 місяць від початку введення культури, перед забоєм і в кінці відновного періоду проводяться також гематологічні дослідження, визначення імунотоксичності і дисбіотичної дії.

5. ВИВЧЕННЯ ДІЇ МІКРОБНОГО ПРЕПАРАТУ НА ІМУННУ СИСТЕМУ ОРГАНІЗМУ

5.1. Визначення порогу імунотоксичної дії

Імунотоксична дія мікробного препарату може проявлятися сенсибілізацією, імунізацією (ознака антигенності мікроорганізму) і неспецифічною імуномодуляцією.

5.1.1. Проведення шкіряних проб

Досліджуваний матеріал (прогріта при 80 град. С жива культура виробничого штаму) суспензується в фізрозчині. 0,05-0,1 куб. см вводиться в оброблену спиртом шкіру зовнішньої поверхні вуха морської свинки за допомогою туберкулінового шприця. При цьому голку треба виймати зигзагоподібно, щоб не було втрати суспензії. Облік реакції - через 20 хв. для виявлення алергії негайного типу і через 24-48 год. для виявлення алергії повільного типу. Позитивна реакція виражається в появі на місці введення речовини почервоніння, припухлості. Використовується 6 дослідних і 6 контрольних тварин.

При необхідності, в залежності від інтенсивності ефектів, може бути використаний більш широкий спектр методів і показників.

5.1.2. Визначення гіперчутливості повільного типу (ГПТ)

     Тварин, які   підлягали  тривалій  щоденній  дії  препаратом,
                                             5
імунізують одноразово внутрішньошкірно 2 х 10  еритроцитів  барана
                                                                 8
в 0,05  куб.  см  фізіологічного розчину.  На 5-у добу вводять 10
еритроцитів в 0,05 куб.  см  фізіологічного  розчину  в  подушечку
задньої лапки (вирішувальна ін'єкція).  В контрольну лапку вводять
фізрозчин в тому ж об'ємі. Місцеву запальну реакцію (інтенсивність
ГУТ)  оцінюють  через  24  год.  по  різниці  товщини  дослідної і
контрольної  лап  (заміряють  інженерним   мікрометром   МК-0-25).
Вираховують середньогрупові показники набряку у тварин контрольної
(6 тварин) і дослідної груп (6  тварин).  Результати  виражають  в
умовних одиницях (у. о.), одна у. о. дорівнює 0,01 мм.
     5.1.3. Визначення антитіл до еритроцитів барану

Щурам дослідної (6 тварин) і контрольної (6 тварин) груп вводять внутрішньочеревинно 0,5 куб. см 50% суспензії еритроцитів барана. На 7-у, 14-у, 21-у, 28 добу після введення еритроцитів із хвостової вени тварин в пробірку вносять по 0,5-1 куб. см крові. Пробірки розміщують в термостаті при +37 град. +-1 град. С на 20 хв, потім переносять в холодильник при +6 град. +-2 град. С на 18 год., після чого пастерівською піпеткою відбирають сироватки, підігрівають їх при +56 град. С впродовж 20 хв на водяній бані, а далі розводять двічі фізрозчином - 1:4, 1:8 і т. д. в об'ємі 0,25-0,5 куб. см на планшетах.

До розведених сироваток добавляють 0,1 куб. см 2% суспензії еритроцитів барана, струшують і витримують при кімнатній температурі.

Попередній облік результатів реакції проводять через 2 год., а остаточний - через 18-24 год.

При позитивній реакції мереживоподібний осад еритроцитів у вигляді тонкої плівки з неправильними хвилястими краями (перевернута парасолька) розподіляється рівномірним шаром по дну. При негативній реакції еритроцити осідають у формі компактного невеликого диску або обручки з рівними краями. Результати реакції виражають в умовних одиницях (титру) - по найбільшому розведенню сироватки, що дає позитивну реакцію, тобто повну аглютинацію 0,1 куб. см 2%-ної суспензії еритроцитів барана. Зменшення титру антитіл свідчить про пригнічення дії препарату на гуморальну ланку імунної відповіді. Збільшення титру свідчить про стимулюючу дію.

5.1.4. Визначення фагоцитарної активності лейкоцитів

     Із досліджуваної  культури  виробничого  штаму мікроорганізму
готують суспензію  на  фізіологічному   розчині   в   концентрації
  9
10 клітин/мл; 0,1 куб. см цієї суспензії добавляють до 0,1 куб. см
гепаринізованої крові дослідних і контрольних тварин,  змішують  і
інкубують при +37 град.  +-1 град.  С впродовж 30 хв.,  після чого
готують мазки для підрахунку формених клітин  крові.  Підраховують
200  нейтрофілів,  вираховують  процент  фагоцитуючих нейтрофілів,
тобто  кількість  лейкоцитів  із  100,  які  виявили   фагоцитарну
активність.  В  дослід  беруться  не  менше  ніж  по 6 тварин як в
дослідній, так і в контрольній групі.
     5.2. Вивчення дисбіотичної дії

5.2.1. При вивченні дії виробничого штаму мікроорганізмів чи мікробного препарату на аутофлору (резидентну мікрофлору) організму як тест-система використовується мікробіоценоз товстого кишечнику лабораторних тварин. На кожну дозу досліджуваного об'єкту використовується не менше 6 тварин. Контрольна група, яка знаходиться в тих же умовах існування, але не отримує продуценту чи біопрепарату, також має мати не менше 6 тварин. Слід зауважити, що тварини, яких застосовують для вивчення аутофлори, не підлягають іншим дослідженням (тобто, в них не відбирають кров, не травмують іншими дослідженнями). Бактеріологічне дослідження вмісту товстого кишечнику тварин проводиться в динаміці: до досліду (фон), через 1 і 2 місяці від початку досліду і в кінці відновного періоду.

5.2.2. Для посіву використовують десятикратні розведення фекалій у фізіологічному розчині. Визначають кількість мікроорганізмів: кишкової палички (засів на середовище Ендо), гемолітичних бактерій (засів на 5%-ний кров'яний агар), ентерококів (на азидовому агарі), стафілококів (засів на сольовий агар), грибів (на середовищі Сабуро), загальну кількість анаеробів (на МПА в анаеростаті).

Всі посіви на аероби інкубують 24-48 год. при +37 град +-1 град. С, посіви на анаероби - 24-48 год. в анаеростаті при +37 град. +-1 град. С. Визначають кількість мікроорганізмів в 1 г фекалій. Критерієм дисбактеріозу слугують зміни, порівняно з контрольною групою, кількісного складу мікрофлори товстого кишечнику дослідних тварин.

5.2.3. Якщо показники кількісного складу мікрофлори більш, ніж по двом групам мікроорганізмів відрізняються від контролю, але після періоду відновлення ці зміни зникають, то дисбіотична дія оцінюється як помірно виражена. При гігієнічному нормуванні дозу (чи концентрацію) виробничого штаму мікроорганізмів чи біопрепарату, яка викликає дисбактеріоз, слід вважати порогом дисбіотичної дії.

Якщо кількісний склад мікрофлори кишечнику дослідних тварин відрізняється від показників контрольної групи хоча б по одній із вивчених груп мікроорганізмів, але зміни не зникають після відновного періоду, то це розглядається як сильна дисбіотична дія. Дозу або концентрацію, яка обумовила сильну дисбіотичну дію, слід вважати діючою за цим ефектом.

6. ГІГІЄНІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

6.1. Дослідження впливу мікробного препарату на процеси мікробного самоочищення води та ґрунту

6.1.1. Дослідження впливу мікробного препарату на санітарний режим води та ґрунту проводиться в випадках, коли має місце забруднення навколишнього середовища. Наприклад, коли при виробництві мікробного препарату спостерігаються викиди виробничих штамів мікроорганізмів в навколишнє середовище і забруднення води водойм чи ґрунту, або, коли мікробні препарати вносяться в навколишнє середовище при їх застосуванні (мікробні пестициди, мікробні біодобрива і стимулятори росту рослин, деструктори хімічних забруднювачів). Досліди проводяться зі штамом мікроорганізму-продуценту - основним діючим інгредієнтом мікробного препарату.

     6.1.2. В  експерименті  з  водою   використовують   акваріуми
ємністю 5  куб.  дм і більше.  Мікроорганізми вносять одноразово в
воду,  відібрану із відкритої водойми в кількості,  що  відповідає
максимальній  нормі  його  сільськогосподарського або екологічного
застосування,  а також на 1-2 порядки вище і нижче.  Досліджуються
терміни   виживаємості  продуценту  в  воді  і  вплив  на  процеси
мікробного  самоочищення  від  санітарно-показової  та  патогенної
мікрофлори.   Для   цього   в   досліджувану  воду  вносять,  крім
виробничого штаму,  також E.  coli,  S.  typhimurium  в  кількості
      5
5 х 10  КУО/куб. дм.

6.1.3. Дію продуценту на процес нітрифікації органічних речовин визначають за вмістом нітритів і нітратів. Контролем слугує вода, в яку не вносився продуцент. Дослідження проводять при кімнатній температурі в динаміці: до внесення продуценту в воду (фон), зразу після внесення і впродовж 1-3 місяців (до зникнення продуценту).

6.1.4. При дослідженні самоочищуючої здатності ґрунту використовують чорнозем або інший ґрунт з хорошою поглинаючою здатністю, високим вмістом гумусу і нейтральною реакцією (рН). Встановлюють вологість на рівні 60% від повної вологоємкості.

Наважки ґрунту (не менше 1 кг) в скляній посудині перемішують з продуцентом та вносять санітарно-показові мікроорганізми. Спостереження проводять в динаміці, як і дослідження води.

6.2. Гігієнічні дослідження умов виробництва мікробного препарату

6.2.1. При наявності дослідного або промислового виробництва необхідно проведення гігієнічних досліджень з метою визначення забруднення повітря робочої зони мікроорганізмами-продуцентами. Для цього використовуються методики, розроблені для кожного конкретного виду виробничого штаму мікроорганізмів.

Крім того, доцільно паралельно проводити визначення загальної кількості мікроорганізмів для оцінки мікробного фону у приміщенні, а також можливого забруднення повітря мікроорганізмами не виробничого призначення. При цьому використовуються загально прийняті поживні середовища.

6.2.2. Для відбору проб повітря на мікробне забруднення використовуються спеціальні прилади для мікробіологічного дослідження повітря (прилад Кротова, Андерсена, багатокаскадні імпактори і інші прилади). При цьому проби повітря засіваються безпосередньо на специфічне для досліджуваного штаму поживне середовище - рідке чи тверде в залежності від приладу.

6.2.3. Поряд з обстеженням повітря у виробничих приміщеннях необхідно проводити медичні огляди працюючих за загальноприйнятою схемою для біотехнологічних підприємств та аналіз захворюваності.

Отримані результати гігієнічних досліджень використовують разом з результатами експериментальних досліджень при обґрунтуванні ГДК біопрепаратів.

6.2.4. Натурні спостереження доцільно проводити після виконання експериментальних токсиколого-гігієнічних досліджень, коли вже мають бути відомі лімітуючі ознаки шкідливості біопрепарату.

Мета гігієнічних досліджень - визначити кількість мікробного препарату (виробничого штаму), яка може надходити в організм людини внаслідок забруднення виробничого чи навколишнього середовища, оцінити реальну загрозу здоров'ю людини та обґрунтувати вимоги щодо умов безпеки процесів виробництва біопрепарату чи його застосування.

7. ОБГРУНТУВАННЯ ВЕЛИЧИНИ ГДК

7.1. При встановленні ГДК мікробних препаратів в різних об'єктах розрахунки слід проводити по основному діючому чиннику - виробничому штаму мікроорганізму-продуценту і подавати її величину в мікробних клітинах (КУО) на одиницю виміру об'єкта середовища, для якого пропонується норматив. Якщо в товарну форму препарату входять декілька штамів мікроорганізмів, то норматив подається за сумою штамів.

     7.2. Величина  ГДК  встановлюється,  виходячи  із лімітуючого
порогу субхронічної дії (імунотоксичного,  дисбіотичного). В разі,
якщо   лімітуючою   ознакою   шкідливої   дії   виробничого  штаму
мікроорганізмів є сенсибілізуюче,  ставиться помітка А  (алерген).
Коефіцієнт  запасу  для  ГДК  в повітрі робочої зони і воді водойм
приймається рівним 10,  а для ГДК в атмосферному повітрі - рівному
100.   Максимальна   величина  ГДК  мікроорганізмів-продуцентів  в
                                                 4
повітрі робочої зони обмежується величиною 5 х 10  КУО/куб. м, а в
                             3
атмосферному повітрі - 5 х 10  КУО/куб. м.
     7.3. При  нормуванні  мікроорганізмів-продуцентів  у  воді чи
ґрунті (в разі обґрунтування необхідності такого нормування)  крім
результатів  токсикологічних  досліджень  враховують також дані по
оцінці впливу на процеси мікробного самоочищення води  чи  ґрунту.
Якщо   лімітуючою   ознакою   шкідливості   є   вплив  на  процеси
самоочищення водойми,  то ГДК встановлюється  на  рівні  порогової
концентрації. Максимальна    величина    ГДК    у   воді   складає
      4
5 х 10  КУО/куб. дм.

7.4. В подальшому гігієнічна перевірка і коригування експериментально встановленої ГДК мікроорганізмів-продуцентів і готових форм препаратів проводиться з використанням методичних прийомів, що прийняті в практиці гігієнічного нормування. Для повітря робочої зони вона передбачає гігієнічну оцінку виробничого середовища і вивчення загальної і професійної захворюваності робітників. Для атмосферного повітря - оцінку забруднення мікроорганізмом-продуцентом або готовою формою препарату повітряного середовища селітебної зони і вивчення захворюваності населення.

ЛІТЕРАТУРА

1. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны. / МЗ СССР, М., 1980. - 20 с.

2. Санитарно-противоэпидемические правила "Безопасность работы с рекомбинантными молекулами ДНК". - М.: МЗ СССР, 1989. - 17 с.

3. Промислова мікробіологія. Терміни та визначення. - ДСТУ 2424-94. - Вид. офіційне. - Київ: Держстандарт України, 1994. - 7 с.

4. Омельянец Т.Г., Мельник Г.П. О некоторых методических приемах оценки дисбактериотического действия микробных средств защиты растений. // Актуальные вопросы гигиены. - Кишинев, 1987, ч. II. С. 22.

5. Omelianets T.G., Artuch V.P., Ganeva S.L. The methodical approaches to biological indications of air wastes of the enterprises of a microbiological industry // Aerosols (Science, devices, soft ware and technologies). 1998, V. 4c, N 1, - P. 123-126.

6. Omelianets T.G. Biological hazards as risk factors in microbiological industry // Pharmacology and Toxicology (An international journal). 1997. v. 80, suppl. III, Copenhagen. - P. 141-143.

7. Методичні рекомендації "Особливості ведення запобіжного та поточного санітарного нагляду за розробкою та впровадженням нормативів гранично-допустимих викидів (ГДВ) біологічних факторів в атмосферне повітря. МР 2.2.6.-004-98 // Збірн. важл. офіційн. матеріалів з сан. і протиепідем. питань. - Київ, 1998. - Т. 5, ч. 2. - С. 59.

8. Омельянец Т.Г., Присяжнюк В.Е., Ганева С.Л. Методические аспекты гигиенической регламентации в воздухе продуктов микробиологического синтеза с низким их выходом из биомассы продуцента / Гигиена населенных мест. Сб. науч. ст. УНГЦ. - Киев, 1998 - Вып. 33. - C. 58-63.

9. Державні санітарні правила ДСП 9.9.5-080-02 "Правила влаштування і безпеки в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю". Київ: МОЗ України, 2002, - 18 С.

10. Директива 2000/54/ЄС від 18.09.2000 р. "Про захист працівників від небезпек, пов'язаних з впливом біологічних агентів на виробництві". - 27 с.